Introduktion till principen och tillämpningen av allmänna komponenter i spektrofotometer

Spektrofotometer används ofta inom biologisk, kemisk, klinisk och miljömässig forskning.
Spektrofotometri mäter hur mycket ljus en kemikalie kan ta upp genom att leda en ljusstråle genom ett prov i en spektrofotometer.
Genom att mäta den detekterade ljusintensiteten kan metoden användas för att bestämma koncentrationen av löst ämne i provet.
Begreppet spektrofotometri
Strålen som skickas till provet består av en fotonstråle.
När fotonerna möter molekylerna i provet kan molekylerna ta upp några av dem, minska antalet fotoner i strålen och minska detektionssignalens intensitet.
Överföringen är en del av det ljus som passerar genom provet. Det definieras som ljusintensiteten som passerar genom provet vid den infallande ljusintensiteten.
Absorbansen är motsatt transmittansen, motsvarande mängden uppmätt med spektrofotometern.
Enligt absorbansen kan koncentrationen av lösningsprovet bestämmas utifrån Lambert-lagen, som visar att det finns ett linjärt samband mellan absorbansen och provkoncentrationen. Enligt öl Lambert-lagen är absorbans produkten av absorptionskoefficient, vilket är ett mått på mängden ljus som absorberas av lösta ämnen vid en viss våglängd och avståndet genom vilket ljus passerar. Prov eller reseavstånd och koncentration av löst ämne. I allmänhet är syftet med att mäta absorbansen att mäta provets koncentration.
Komponenter av spektrofotometer
Varje spektrofotometer består av en ljuskälla, en kollimator (lins eller en fokuseringsanordning för överföring av starka och raka strålar), en monokromator för att separera strålar med olika våglängder och en längdväljare för att välja våg eller spår med önskad våglängd. Våglängden för ljuset som används i spektrofotometern som presenteras i den här videon ligger inom området ultraviolett och synligt ljus. Spektrofotometern inkluderar också en provhållare, en fotodetektor och en skärm som visar resultaten av detektorn.
Den senaste spektrofotometern är direkt kopplad till en dator, där experimentella parametrar kan kontrolleras och resultaten visas.
Arbetsprincip för spektrofotometer
När du utför spektrofotometri är det viktigt att vidta lämpliga försiktighetsåtgärder, t.ex. att bära handskar, beroende på vilken typ av biologisk eller kemisk lösning du använder.
Slå på enheten och låt lampan och elektroniken värmas innan du mäter provets UV-Vis-spektrum.
Förbered ett tomt prov av samma lösning med samma pH och liknande jonstyrka, men utan komponenterna som ska analyseras; eftersom kyvetten och lösningsmedlet kan sprida ljus är det nödvändigt att analysera provet.
Den traditionella spektrofotometerprovhållaren är utformad för att hålla plast- och kvartsskålar. Pipettera den ursprungliga lösningen i en skål.
När du har torkat bort några fingeravtryck och stänk dem på utsidan av skålen, sätt in kyvetten korrekt i provhållaren och stäng locket.
Glöm aldrig att stänga dörren eftersom UV-strålning från en öppen spektrofotometer kan skada dina ögon och hud.
Programmera den önskade våglängden eller våglängdsområdet som överförs till provet. Detta beror på den bästa våglängden som komponenten som analyseras kan absorbera. Maskinen nollställs sedan genom att mäta det tomma provet, vilket subtraherar bottenabsorberingen på grund av provbufferten.
Beroende på vilken typ av spektrofotometri-experiment du gör kan det vara nödvändigt att generera en standardkurva före provmätningen, från vilken koncentrationen av den förening som analyseras i provet kan bestämmas.
Låt provet nå rätt temperatur och blanda försiktigt för att undvika att bubblor införs. Provet kan sedan läggas direkt till skålen inuti maskinen och en avläsning kan göras.
Efter att provet har uppmätts för absorbans beräknas experimentet korrekt; till exempel för att bestämma koncentrationen eller enzymaktivitetsnivån.
Användning av spektrofotometer
En av de vanliga användningarna av spektrofotometer är att mäta celldensitet. Celltäthetsmätning kan användas för att producera den logaritmiska tillväxtkurvan för bakterier, från vilken den optimala tiden för integration av rekombinant protein kan bestämmas.
Spektrofotometern kan också användas för att mäta den kemiska reaktionshastigheten. I denna utföringsform används absorbansen för att övervaka den enzymatiska reaktionen, som försvinner med tiden genom en mellanreaktion på 452 nm. Hastigheten för detta enzymatiska steg kan beräknas genom att matcha data med lämplig ekvation.
Införandet av mikrospektrofotometer eliminerar behovet av provhållare. Dessa spektrofotometrar använder ytspänning för att bibehålla provet.
Mikrospektrofotometer är det bästa valet för att mäta massan och koncentrationen av små och dyra prover, t.ex. biomolekyler, inklusive proteiner och nukleinsyror.
Absorptionen av proteiner vid 280 nm beror på innehållet i aromatiska sidokedjor som finns i tryptofan, tyrosin och fenylalanin, såväl som disulfidbindningen mellan de två cysteinerna.
Proteinkoncentrationen kan bestämmas genom dess absorbans vid 280 nm och dess absorptionskoefficient, som är baserad på sammansättningen av aminosyror.
DNA och RNA har den maximala absorbansen vid 260 nm, från vilka deras koncentrationer kan bestämmas. Renheten hos nukleinsyror kan också utvärderas från förhållandet mellan absorbansavläsningar och specifika våglängder.