Spektrofotometrisk kolorimetrisk proteinkvantificering
Proteiner är vanligen en blandning av proteiner. Colorimetriska analyser är baserade på proteinkomponenter: Aminosyror (t ex tyrosin, serin) reagerar med en ytterligare kromogen grupp eller färgämne för framställning av ett färgat material. Koncentrationen av det färgade materialet är direkt relaterat till antalet aminosyror som proteinet reagerar och reflekterar därmed proteinkoncentrationen.
Colorimetrisk metod
Det finns flera metoder som BCA, Bradford och Lowry.
Lowrymetoden: Baserat på den tidigaste Biuret-reaktionen och förbättrad. Proteinet reagerar med Cu2 för att ge en blå reaktion. Lowry-metoden är emellertid mer känslig än Biuret. Nackdelen är behovet att sekventiellt tillsätta flera olika reagens; reaktionen tar lång tid; är mottaglig för icke-proteinämnen proteiner innehållande EDTA, Triton x-100 och ammoniaksulfat är inte lämpliga för denna metod.
Bicinchoniininsyraanalys: Detta är en nyare, mer känslig proteinanalys. Proteinet som ska analyseras reagerar med Cu2 i en alkalisk lösning för framställning av Cu, vilket bildar ett kelat med BCA för att bilda en lila förening med en absorptions-topp vid 562 nm. Det linjära förhållandet mellan koncentrationen av denna förening och proteinet är stark, och föreningen som bildas efter reaktionen är mycket stabil. I förhållande till Lowry-metoden är operationen enkel och känsligheten är hög. Liksom Lowry-metoden är den dock känslig för störningar av proteiner och tvättmedel.
Bradfordmetoden: Principen för denna metod är att proteinet reagerar med Coomassie Brilliant Blue för att producera en färgad förening som absorberar vid 595 nm. Dess största funktion är dess känslighet, vilket är 2 gånger så lågt som Lowry och BCA. Det är enklare och snabbare. Det kräver bara en typ av reaktionsreagens. Föreningen kan vara stabil i 1 timme för att underlätta resultatet; Interfererar med Lowry, reagerar BCA med reduktionsmedel (t.ex. DTT, merkaptoetanol) kompatibelt. Det är dock fortfarande känsligt för tvättmedel. Den huvudsakliga nackdelen är att olika standarder kan leda till stora skillnader i resultaten av samma prov och inga jämförbara resultat.
Vissa forskare som utsätts för kolorimetriska mätningar för första gången kan vara förvirrade av resultaten av de olika kolorimetriska testen. Vilken typ av metoder tror du att vara förvirrad? På grund av det faktum att grupperna reagerade på olika sätt och de kromogena grupperna inte är desamma används flera metoder samtidigt för att göra provkoncentrationerna av samma prov inkonsekvent. Exempelvis beskriver Keller et al. testade proteinet i mjölk och fann att koncentrationerna uppmätta av Lowry och BCA var signifikant högre än hos Bradford. Skillnaden var signifikant. Även om samma prov bestäms är standardprovet valt med samma kolorimetriska metod inkonsekvent, och koncentrationen efter testet är också inkonsekvent. Använd till exempel Lowry för att testa proteinet i cellhomogenatet, med BSA som standard, med en koncentration av 1,34 mg / ml och ett globulin som standard med en koncentration av 2,64 mg / ml. Därför, före val av en kolorimetrisk metod, är det föredraget att referera till den kemiska sammansättningen av provet som skall testas och hitta ett kemiskt liknande standardprotein som en standard. Dessutom orsakar den kolorimetriska metoden för kvantifiering av proteiner ofta problem med att absorbansvärdet för provet är för lågt vilket resulterar i en stor skillnad mellan den uppmätta provkoncentrationen och den faktiska koncentrationen. Huvudfrågan är att färgen på den viktiga delen av 1011 spektrofotometern, kyvetten, har en viss halveringstid, så varje kolorimetrisk metod listar reaktionstesttiden. Alla prov (inklusive standardprover) måste testas inom denna tid. Om tiden är för lång blir det erhållna absorbansvärdet mindre och det konverterade koncentrationsvärdet minskar. Dessutom är reaktionstemperaturen, lösningens pH-värde etc. alla viktiga faktorer som påverkar experimentet. Dessutom är det mycket viktigt att använda plastfärgimetri. Undvik att använda kuvetter av kvarts eller glas eftersom färgen efter reaktionen kommer att orsaka att kvarts eller glas färgas, vilket resulterar i felaktig absorption av provet.
Företaget är specialiserat på försäljning av spektrofotometrar , välkomna kunder som har behov av att konsultera och köpa, vi kommer att ge dig uppriktiga service- och kvalitetsprodukter samt lägre priser.
E-post: info@sumerlab.com
Web: sumerinstrument.com