Spektrofotometrar har blivit rutininstrument i moderna molekylärbiologiska laboratorier. Används ofta för nukleinsyra, proteinkvantifiering och kvantifiering av bakterietillväxtkoncentrationer.
Enkel princip för spektrofotometer
Spektrofotometern använder en ljuskälla som kan generera flera våglängder och passerar genom en serie spektroskopiska enheter för att generera en ljuskälla med en specifik våglängd. Efter det att ljuskällan passerar genom provet som ska testas, absorberas en del av ljuskällan, och absorbans av provet beräknas och därigenom omvandlas till en provkoncentration. . Provets absorbans är proportionell mot provets koncentration.
Kvantifiering av nukleinsyror
Kvantifieringen av nukleinsyror är den mest använda funktionen för spektrofotometern. Oligonukleotider, enkelsträngat, dubbelsträngat DNA och RNA kan kvantifieras i en buffert. Absorptionstoppen för den högsta absorptionstoppen för nukleinsyra är 260 nm. Molekylkompositionen för varje nukleinsyra är olika, så omvandlingsfaktorerna är olika. För att kvantifiera olika typer av nukleinsyror, välj motsvarande koefficienter i förväg. Exempelvis motsvarar absorbansen av 1 OD 50 μg / ml dsDNA, 37 μg / ml ssDNA, 40 μg / ml RNA och 30 μg / ml Olig. Absorbansen efter testet omvandlas av ovanstående koefficienter för att erhålla motsvarande provkoncentration. Välj rätt procedur innan testning, ange volymen för stamlösningen och utspädningsmedlet och testa sedan ämnet och provlösningen. Experimentet var dock inte alltid smidigt. Instabila avläsningar kan vara den största huvudvärken för experimenteraren. Instrument med högre känslighet uppvisar större drift i absorbansen.
I själva verket tillåter spektrofotometerens designprincip och arbetsprincip att absorbansen varierar inom ett visst intervall, det vill säga instrumentet har viss noggrannhet och precision. Exempelvis är noggrannheten för Eppendorf Biophotometer ≤1,0% (1A). Resultaten av sådana multipla test varierar mellan cirka 1,0% av medelvärdet och är normala. Dessutom är det också nödvändigt att beakta de fysikalisk-kemiska egenskaperna hos själva nukleinsyran och pH i bufferten i vilken nukleinsyran är upplöst, jonkoncentrationen, etc.: När jonkoncentrationen är för hög under testet, lässkift, så det rekommenderas att använda ett visst pH-värde och en låg jonkoncentration. Buffertar, såsom TE, stabiliserar avsevärt avläsningarna. Provets utspädningskoncentration är också en faktor som inte kan ignoreras: på grund av den oundvikliga närvaron av vissa fina partiklar, särskilt nukleinsyraprover, i provet. Närvaron av dessa små partiklar påverkar testresultaten. För att minimera partiklernas effekt på testresultaten krävs att nukleinsyrans absorbans är minst större än 0,1 A, och absorbansen är företrädesvis mellan 0,1 och 1,5 A. Inom detta område är interferensen av partiklarna är relativt små och resultatet är stabilt.
Detta innebär att provets koncentration inte bör vara för låg eller för hög (utanför fotomätarens testområde). Slutligen bör driftsfaktorerna, såsom blandning, vara tillräckliga, annars är absorbansvärdet för lågt, till och med negativa värden; blandningen kan inte existera bubblor, den tomma vätskan har inget suspenderat ämne, annars drivs avläsningen drastiskt; samma kyvett måste användas för att testa ämnet och provet. Annars är skillnaden i koncentration för stor; omvandlingsfaktorn och provkoncentrationsenheten väljs konsekvent; kyvetten med fönsterslitage kan inte användas; provets volym måste nå den minsta volym som krävs av kyvetten.
Förutom nukleinsyrakoncentrationen uppvisar spektrofotometern också flera mycket viktiga förhållanden som indikerar provets renhet, såsom förhållandet A 260 / A 280, som används för att bedöma provets renhet eftersom proteinets absorptionstopp är 280 nm. Ett rent prov med ett förhållande större än 1,8 (DNA) eller 2,0 (RNA). Om förhållandet är lägre än 1,8 eller 2,0, indikerar det närvaron av protein eller fenoliska substanser. A 230 indikerar att vissa föroreningar finns i provet, såsom kolhydrater, peptider, fenoler, etc., och förhållandet mellan den renare nukleinsyran A 260 / A 230 är större än 2,0. En 320 detekterar lösningens turbiditet och andra störningsfaktorer. För rena prover är A 320 i allmänhet 0.
Hangzhou Sumer Instrument Co., Ltd.
Lägg till: No.168 Wuchang Ave., Yuhang District, Hangzhou 310023, Kina
TEL: + 86-571-88739859
Telefon: +8618658504900
E-post: info@sumerlab.com
Webb: sumerinstrument.com